88 просмотров
Рейтинг статьи
1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд
Загрузка...

Что такое рнк вируса

Вирусные РНК

Из нескольких сотен известных в настоящее время вирусов человека и животных РНК-геном содержит около 80% вирусов. Способность РНК хранить наследственную информацию является уникальной особенностью вируса.

У просто организованных и некоторых сложно органи­зованных вирусов вирусная РНК в отсутствие белка может вызвать инфекционный процесс. Впервые инфекционная активность РНК вируса табачной мозаики была продемонстрирована X. Френкель-Конратом и соавт. в 1957 г. и А. Гирером и Г. Шраммом в 1958 г. Впоследствии положение об инфекционной активности РНК было пере­несено на все РНК-содержащие вирусы, однако долголет­ние усилия доказать это для таких вирусов, как вирусы гриппа, парамиксовирусы, рабдовирусы (так называемые минус-нитевые вирусы), оказались бесплодными: у этих ви­русов инфекционной структурой являются не РНК, а комплекс РНК с внутренними белками. Таким образом, геномная РНК может обладать инфекционной активно­стью в зависимости от своей структуры.

Структура вирусных РНК чрезвычайно разнообразна. У вирусов обнаружены однонитчатые и двунитчатые, ли­нейные, фрагментированные и кольцевые РНК. РНК-геном в основном является гаплоидным, геном ретровирусов — диплоидный, т. е. состоит из двух идентичных молекул РНК.

Однонитчатые РНК.Молекулы однонитчатых вирусных РНК существуют в форме одиночной полинуклеотидной цепи со спирализованными ДНК-подобными участками. При этом некомплементарные нуклеотиды, разделяющие комплементарные участки, могут выводиться из состава спирализованных участков в форме различных «петель» и «выступов» Суммарный процент спирализации вирусных РНК не обнаруживает каких-либо особенностей по сравнению с таковыми у клеточных РНК.

Вирусы, содержащие однонитчатые РНК,делятся на две группы. У вирусов первой группы вирусный геном обладает функциями информационной РНК, т. е. может непосредственно переносить закодированную в нем инфор­мацию на рибосомы. По предложению Д. Балтимора РНК со свойствами информационной условно обозначена знаком «плюс» и в связи с этим вирусы, со­держащие такие РНК (пикорнавирусы, тогавирусы, коро-навирусы, ретровирусы), обозначены как «плюс-нитевые» вирусы, или вирусы с позитивным геномом.

Вторая группа РНК-содержащих вирусов содержит ге­ном в виде однонитчатой РНК, которая сама не обладает функциями иРНК. В этом случае функцию иРНК выпол­няет РНК, комплементарная геному. Синтез этой РНК (транскрипция) осуществляется в зараженной клетке на матрице геномной РНК с помощью вирусспецифического фермента — транскриптазы. В составе «минус-нитевых» вирусов обязательно присутствие собственного фер­мента, осуществляющего транскрипцию геномной РНК и синтез иРНК, так как аналога такого фермента в клетках нет. Геном этих вирусов условно обозначают как «минуса-РНК, а вирусы этой группы как «минус-нитевые» вирусы, или вирусы с негативным геномом. К этим вирусам отно­сятся ортомиксовирусы, парамиксовирусы, буньявирусы, рабдовирусы. РНК этих вирусов не способна вызвать инфекционный процесс.

В соответствии с разными свойствами вирусных РНК между двумя группами вирусов есть и структурные разли­чия. Поскольку РНК «плюс-нитевых» вирусов выполняет функцию иРНК, она имеет специфические структурные особенности, характерные для 5′- и З’-концов этих РНК. На З’-конце информационных РНК имеются поли (А), количество которых достигает 200 и выше. Эти модификации концов иРНК, осуществляе­мые после синтеза полинуклеотидной цепи, имеют сущест­венное значение для функции иРНК: «шапочка» нужна для специфического узнавания иРНК рибосомами, функ­ции поли (А) менее точно определены и, по-видимому, заключаются в придании стабильности молекулам иРНК.

Такими же модифицированными концами обладают ге­номные РНК «плюс-нитевых» вирусов. Исключение со­ставляет 5′-конец геномной РНК вируса полиомиелита, которая не содержит «шапочку», и вместо нее имеет на 5′-конце ковалентно присоединенный к остатку урацила низкомолекулярный терминальный белок. Геномные РНК «минус-нитевых» вирусов не имеют ни «шапочки», ни по­ли (А); модифицированные концы характерны для иРНК этих вирусов, синтезирующихся в клетке на матрице вирионной РНК и комплементарных ей. Геномная РНК ретровирусов, хотя и является «плюс-нитевой», однако не содержит «шапочку»; эту структуру содержит гомологич­ная РНК, синтезируемая на матрице интегрированной про-вирусной ДНК.

Существуют вирусы, содержащие как «плюс-нитевые», так и «минус-нитевые» РНК гены (амбисенс-вирусы). К ним относятся аренавирусы.

В основном однонитчатые РНК являются линейными молекулами, однако РНК-фрагменты буньявирусов обна­ружены в виде кольцевой формы. Кольцевая форма воз­никает за счет образования водородных связей между концами молекул.

Двунитчатые РНК.Этот необычный для клетки тип нуклеиновой кислоты, впервые обнаруженный у реовирусов, широко распространен среди вирусов животных, растений и бактерий. Вирусы, содержащие подобный геном, называют диплорнавирусы.

Общей особенностью диплорнавирусов является фрагментированное состояние генома. Так, геном реовирусов состоит из 10 фрагментов, ротавирусов — из 11 фрагмен­тов.

Молекулярная масса РНК таких вирусов варьирует в широких пределах.

БЕЛКИ

В зараженной клетке вирусный геном кодирует синтез двух групп белков: 1) структурных, которые входят в со­став вирусных частиц потомства, и 2) неструктурных, которые обслуживают процесс внутриклеточной репродук­ции вируса на разных его этапах, но в состав вирусных частиц не входят.

Структурные белки. Количество структурных белков в составе вирусной частицы варьирует в широких пределах в зависимости от сложности организации вириона. Наибо­лее просто организованный вирус табачной мозаики со­держит всего один небольшой белок с молекулярной массой 17—18- 10 3 , некоторые фаги содержат 2—3 белка, просто организованные вирусы животных — 3—4 белка. Сложно устроенные вирусы, такие как вирусы оспы, содержат более 30 структурных белков.

Структурные белки делятся на 2 группы:

1) капсидные белки, образующие капсид, т. е. футляр для нуклеиновой кислоты вируса (от лат. capsa — вме­стилище), и входящие в состав капсида геномные белки, и ферменты;

2) суперкапсидные белки, входящие в состав суперкапсида, т. е. наружной вирусной оболочки.

Поскольку суперкапсид называют также «пеплос» (от греч. peplos — покров, мантия), эти белки называют пепломерами.

Просто организованные вирусы, представляющие собой нуклеокапсид, содержат только капсидные белки. Сложно организованные вирусы содержат капсидные и суперкапслдные белки.

Капсидные белки. Первоначальное представление о том, что капсидные белки являются всего лишь инерт­ной оболочкой для вирусной нуклеиновой кислоты, сложи­лось на основании изучения наиболее просто организо­ванного вируса табачной мозаики, частица которого со­стоит из одной молекулы РНК и одного типа белка, образующего чехол для РНК. Однако такое представление неправильно. Хотя основной функцией капсидных белков является функция защиты вирусного генома от неблаго­приятных воздействий внешней среды, у многих вирусов в составе капсида есть белки и с другими функциями. Поэтому термин «капсид» далеко выходит за пределы представления о нем как о футляре или чехле для вирус­ной нуклеиновой кислоты.

В составе капсида некоторых вирусов (пикорнавирусы, паповавирусы, аденовирусы) содержатся белки, ковалентно связанные с вирусным геномом (геномные белки). Эти белки являются терминальными, т. е. соединенными с концом вирусной нуклеиновой кислоты. Функции их неразрывно связаны с функциями генома и их регуля­цией.

У ряда сложно организованных вирусов в составе кап­сида имеются ферменты, осуществляющие транскрипцию и репликацию вирусного генома — РНК и ДНК (РНК-и ДНК-полимеразы), а также ферменты, модифицирую­щие концы иРНК. Если ферменты и геномные белки представлены единичными молекулами, то капсидные бел­ки представлены множественными молекулами. Эти белки и формируют капсидную оболочку, в которую у сложно организованных вирусов вставлены молекулы белков с дру­гими функциями.

Основным принципом строения капсидной оболочки вирусов является принцип субьединичности, т. е. построе­ние капсидной оболочки из субъединиц-капсомеров, обра­зованных идентичными полипептидными цепями. Пра­вильно построенные белковые субъединицы — капсомеры возникают благодаря способности вирусных капсидных белков к самосборке. Самосборка объясняется тем, что упорядоченная структура — капсид имеет наименьшую свободную энергию по сравнению с неупорядоченными белковыми молекулами. Сборка капсидной оболочки из субъединиц запрограммирована в первичной структуре белка и происходит самопроизвольно или при взаимо­действии с нуклеиновой кислотой.

Принцип субъединичности в строении вирусного капси­да является универсальным свойством капсидных белков и имеет огромное значение для вирусов. Благодаря этому свойству достигается огромная экономия генетического материала. Если бы капсидная оболочка была построена из разных белков, то на кодирование ее потребовалась бы основная часть генетической информации, заложенной в вирусном геноме. В действительности на кодирование, например, одной полипептидной цепи вируса табачной мозаики, расходуется менее 10% генома. Далее, в меха­низме самосборки заложена возможность контроля за полноценностью вирусных полипептидов: дефектные и чу­жеродные полипептидные цепи при таком способе сборки вирионов будут автоматически отбрасываться.

Описанная способность к самосборке в пробирке и в зараженной клетке характерна только для простых виру­сов. Сборка сложно организованных вирусов является го­раздо более сложным многоступенчатым процессом, хотя отдельные ее этапы, например формирование капсидов и нуклеокапсидов, также основаны на самосборке.

Суперкапсидные белки. Гликопротеиды. Суперкапсидные белки, или пепломеры, располагаются в липопротеидной оболочке (суперкапсиде или пеплосе) сложно устроенных вирусов. Они либо пронизывают насквозь липидный бислой как, например, гликопротеиды альфа-вирусов (вируса леса Семлики), либо не доходят до внутренней поверхности. Эти белки являются типичны­ми внутримембранными белками и имеют много общего с клеточными мембранными белками. Как и последние, суперкапсидные белки обычно гликозилированы. Углевод­ные цепочки прикреплены к молекуле полипептида в опре­деленных участках. Гликозилирование осуществляют кле­точные ферменты, поэтому один и тот же вирус, проду­цируемый разными видами клеток, может иметь разные у углеводные остатки: может варьировать как состав угле­водов, так и длина углеводной цепочки и место прикреп­ления ее к полипептидному остову.

У большинства вирусов гликопротеиды формируют «шипы» на поверхности вирусной частицы, длина которых достигает 7—10 им. Шипы представляют собой морфоло­гические субъединицы, построенные из нескольких моле­кул одного и того же белка. Вирусы гриппа имеют два типа шипов, построенных соответственно из гемагглютинина и нейраминидазы. Парамиксовирусы также имеют два типа шипов, построенных соответственно из двух глико-протеидов (HN и F), рабдовирусы имеют только один гликопротеид и, соответственно, один тип шипов, а альфа-вирусы имеют два или три гликопротеида, формирующих один тип шипов.

Гликопротеиды являются амфипатическими молекула­ми: они состоят из наружной, гидрофильной части, кото­рая содержит на конце аминогруппу (N-конец), и погру­женной в липидный бислой, гидрофобной части, которая содержит на погруженном конце гидроксильную группу (С-конец). С-концом полипетид «заякоривается» в липидном бислое. Есть, однако, и исключения из этого общего положения: нейраминидаза вируса гриппа взаимодействует с липидным бислоем не С-, а N-концом.

Основной функцией гликопротеидов является взаимо­действие со специфическими рецепторами клеточной поверхности. Благодаря этим белкам осуществляется рас­познавание специфических клеточных рецепторов и прик­репление к ним вирусной частицы, т. е. адсорбция вируса на клетке. Поэтому гликопротеиды, выполняющие эту функцию, называют вирусными прикрепительными белка­ми.

Другой функцией гликопротеидов является участие в слиянии вирусной и клеточной мембран, т. е. в событии, ведущем к проникновению вирусных частиц в клетку. Ви­русные белки слияния ответственны за такие процессы, как гемолиз и слияние плазматических мембран соседних кле­ток, приводящие к образованию гигантских клеток, синцитиев и симпластов.

«Адресная функция» вирусных белков. Вирусы вызывают инфекционный процесс у относительно небольшого круга хозяев. Вирус должен «узнать» чувст­вительную клетку, которая сможет обеспечить продукцию полноценного вирусного потомства. Если бы вирус прони­кал в любую клетку, которая встретилась на его пути, это привело бы к исчезновению вирусов в результате деструк­ции ««родительской» вирусной частицы и отсутствия вирус­ного потомства. В процессе эволюции у вирусов выраба­тывалась так называемая адресная функция, т. е. поиск чувствительного хозяина среди бесконечного числа нечув­ствительных клеток. Эта функция реализуется путем на­личия специальных белков на поверхности вирусной ча­стицы, которые узнают специфический рецептор на по­верхности чувствительной клетки.

Читать еще:  Чем она опасна дискинезия

Неструктурные белки. Неструктурные белки изучены гораздо хуже, чем структурные, поскольку их выделяют не из очищенных препаратов вирусов, а из зараженных клеток, и возникают трудности в их идентификации и очи­стке от клеточных белков.

К неструктурным белкам относятся:

1) предшественники вирусных белков, которые отлича­ются от других неструктурных белков нестабильностью в зараженной клетке в результате быстрого нарезания на структурные белки;

2) ферменты синтеза РНК и ДНК (РНК- и ДНК- полимеразы), обеспечивающие транскрипцию и реплика­цию вирусного генома;

4) ферменты, модифицирующие вирусные белки, на­пример протеиназы и протеинкиназы.

Однако многие неструктурные белки при ряде вирус­ных инфекций еще не идентифицированы и функции их не определены.

Вирус гепатита С: кач. РНК обнаружено — что это значит?

Для диагностики ВГC часто используется процедура качественного анализа. Это отдельная методика, дающая весьма точные результаты. На сегодняшний день это один из лучших способов определить наличие (или отсутствие) вируса гепатита C. Анализ может принести два результата. Вот возможные варианты:

  • Вирус гепатита C кач. РНК не обнаружен – что это значит? Ответ прост: в крови нет фрагментов рибонуклеиновой кислоты ВГC. А если гепатит C РНК не обнаружено, то человек здоров;
  • Вирус гепатита С кач. РНК обнаружено – что это значит? В этом случае анализ показал, что человек болен гепатитом C. Или, как минимум, инфицирован. Следовательно, ему требуется лечение.

Здесь обязательно нужно разобраться с сокращением «кач.», имеющемся в диагнозе. С его помощью врачи обозначают, что проводился именно качественный анализ крови. Если этого сокращения нет, то вполне возможно, что диагноз ставился иным способом. В частности, мог использоваться так называемый количественный анализ.

В целом, если гепатит C РНК не обнаружено, что это значит? А значит, что поводов для беспокойства нет. В случае если в крови нет и намека на ВГC, то лечение не требуется: организм справился с болезнью своими силами. Если же фрагменты рибонуклеиновой кислоты ВГC есть, то надо назначать соответствующий курс приема лекарств.

Основные особенности качественного анализа на наличие ВГC в крови

Гепатит C относится к заболеваниям, которые непросто диагностировать. Внешние признаки наличия этого вируса бессистемны, более того, в ряде случаев он себя никак не проявляет. Поэтому очень важно знать, как выявить наличие этой болезни у пациента. Здесь на помощь приходит качественный анализ крови. С его помощью устанавливается наличие или отсутствие фрагментов РНК ВГC в плазме крови.

Качественный анализ на наличие гепатита C проводится по методу полимеразной цепной реакции, сокращенно – ПЦР. Суть метода такова: используются особые ферменты, копирующие фрагменты РНК возбудителя гепатита C (или любого другого заболевания). После получения анализов лаборанты проверяют пробы по базе данных, выявляя разновидность вируса и его концентрацию в крови.

Специалисты называют следующие преимущества данного метода:

  • Точность проверки. При правильном подходе специалисты способны гарантированно определить наличие/отсутствие вируса, равно как и его тип;
  • Быстрое получение результатов анализов. Опытные лаборанты способны представить результат в течение 6-7 часов. Даже с учетом очереди, пациент получает требуемую информацию в кратчайшие сроки;
  • Высокая чувствительность используемого оборудования. То есть, количество единиц вируса на миллилитр крови (МЕ/мл) может быть весьма низким, но анализ все равно выявит наличие инфекции;
  • Низкая цена вопроса. В целом, проводимый анализ мало отличается по цене от других методик. При этом надежность метода качественного анализа (ПЦР) гораздо выше альтернативных вариантов.

Но имеется ряд важных моментов, которые стоит принимать в расчет при проведении анализа. В частности, нужно обращаться только в те клиники, в которых работают действительно хорошие специалисты. Малейшая неточность в работе сделает результат бесполезным. Более того, в этом случае возможно неправильное определение генотипа вируса, либо анализ покажет, что вирус в крови отсутствует. То есть, ценность результатов станет даже отрицательной.

Еще нужно учитывать, что у любого оборудования имеется нижний предел обнаружения вируса. То есть, если инфекция имеется в ничтожно малом количестве, она не будет обнаружена даже с помощью лучших приборов. Поэтому, при наличии подозрений на ВГC, рекомендуется повторить процедуру через определенный срок.

Принципы проведения качественного анализа на ВГC

В целом, к пациенту не имеется особых требований по подготовке к сдаче анализов. Все, что нужно сделать – сдать небольшое количество крови. Строго рекомендуется делать это натощак: в этом случае результаты диагностики будут более точными.

Стоит знать, что качественный анализ по методу ПЦР обычно назначается не сразу. Его рекомендуют проводить в следующих случаях:

  • Обнаружение антител вируса гепатита C в крови пациента.
  • Был обнаружен ВГC, но антитела в крови не имеются.
  • При контроле проводимой противовирусной терапии.

В первых двух случаях качественный анализ назначается после сероконверсии. Если антител нет, но вирус обнаружен, нужно понять: какой именно генотип ВГC присутствует, и почему иммунная система не реагирует. Если есть антитела, то анализ позволяет разобраться: нужно ли лечение, или организм самостоятельно поборол болезнь.

Наконец, при контроле противовирусной терапии анализ делается для проверки эффективности лечения. В частности, метод ПЦР позволит понять, как препараты воздействуют на уже обнаруженный ВГC. Если эффект слабый, то на основе анализов врач решает, нужно ли менять лечение. Стоит запомнить: при контроле противовирусной терапии требуется особо чувствительное оборудование, способное обнаружить РНК гепатита C даже в самой низкой концентрации.

Заключение

Итак, для лучшего запоминания стоит напомнить, что означает тот или иной диагноз, поставленный при качественном анализе. Здесь имеются два варианта:

  • Вирус гепатита C кач. РНК обнаружено – что это значит? Второй вариант, более короткий – гепатит C РНК обнаружено. Это, как его называют, положительный результат. Он означает, что в крови имеются фрагменты рибонуклеиновой кислоты ВГC. И человек инфицирован данным заболеванием.
  • Вирус гепатита C РНК не обнаружен – что это значит? Либо, гепатит C РНК не обнаружено – что это значит, опять же? Это уже отрицательный результат. Анализ не обнаружил в крови фрагментов вируса. А значит, что организм победил инфекцию, и лечение не требуется.

Стоит запомнить: если человек инфицирован, то лечение надо начинать незамедлительно. Любое промедление в этом вопросе может иметь самые тяжелые последствия. И, конечно же, лечиться надо под руководством специалиста.

РНК-СОДЕРЖАЩИЕ ВИРУСЫ

1 — парамиксовирусы; 2 — вирусы гриппа; 3 — коронавирусы; 4 — аренавирусы; 5 — ретровирусы; 6 — реовирусы; 7 — пикорнавирусы; 8 — капицивирусы; 9 — рабдовирусы; 10 — тогавирусы, флавивирусы; 11 — буньявирусы

РНК-содержащие вирусы (РНК-» РНК). не имеют ДНК; генетическая информация закодирована в РНК. РНК может быть одно и двуцепочечной, а клетка-хозяин — про, или эукариотической. Только вирусы с одноцепочечной РНК заражают бактерии, а эукариотические вирусы могут быть как одно — так и двухцепочечными.

Геномы почти всех известных РНК-содержащих вирусов — это линейные молекулы, их удобно разделить на 3 группы.

Первая группа — это однонитевые геномы положительной полярности, т.е. с нуклеотидной последовательностью, соответствующей таковой у мРНК.

— Такие геномы обозначают как (+) РНК.

— Вирусные (+) РНК-геномы кодируют несколько белков, среди которых РНК-зависимая РНК-полимераза (репликаза), способная синтезировать молекулы РНК без участия ДНК.

— С помощью этого фермента синтезируются сначала (-) нити РНК фага,

— затем при наличии особого белка, называемого «хозяйским фактором», репликаза осуществляет синтез (+) нити РНК.

— на заключительной стадии из накопившихся вирусных белков и (+) РНК формируются вирионы.

— Упрощенная схема этого процесса такова:

— Однонитевый (+) РНК-геном характерен для

б) вирусов табачной мозаики,

Вирус табачной мозаики — пример + одноцепочечного вируса растенийвирус не имеет оболочки, спиральный, содержит 2130 идентичных молекул белка капрсида и одну цепь РНК. РНК располагается в спиральном желобке, обрапзованном белковыми субъединицами, и удерживается многочисленными слабыми связями.

Инфекционный процесс, протекающий по схеме (прозрачка 2 внизу), состоит в проникновении вируса в растительную клетку с последующей быстрой утратой им капсида. Затем в результате трансляции непосредственно +одноцепочечной вирусной РНК рибосомами клетки-хозяина образуются несколько белков, часть которых необходима для репликации вирусного генома.

Репликация осуществляется РНК-репликазой, продуцирующей копии РНК для новых вирионов. Синтез белка капсида происходит только после того как инфицировавшая клетку РНК подвергается некоторой модификации, делающей возможным присоединение рибосом клетки к тому участку РНК, которым кодируется этот белок. Сборка вириона начинается с образования дисков из белка капсида. Два таких белковых диска, располагаясь концентрически, образую похожую на бисквит структуру, которая после связывания с ней РНК приобретает форму спирали. Последующее присоединение молекул белка продолжается до тех пор, пока РНК не будет покрыта полностью. В своей окончательной форме вирион представляет собой цилиндр длиной 300 нм.

4) клещевого энцефалита.

Вторая группа — это однонитевые геномы с негативной полярностью, т.е. (-) РНК-геномы.

Поскольку (-) РНК не может выполнять функции мРНК, для образования «своих» мРНК вирус внедряет в клетку не только геном, но и фермент, умеющий снимать с этого генома комплементарные копии по схеме:

— Этот вирусный фермент (РНК-зависимая РНК-полимераза, синтезированная в предыдущем цикле размножения) упакован в вирионе в удобной для доставки в клетку форме.

— Инфекционный процесс начинается с того, что вирусный фермент копирует вирусный геном, образуя (+) РНК, которая выступает в качестве матрицы для синтеза вирусных белков, в том числе РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая входит в состав образующихся вирионов

— К вирусам с негативным РНК-геномом относятся

а) вирусы гриппа,

г) желтой карликовости картофеля и др.

— схема вируса гриппа

Вирус гриппа — это пример вируса с «-»-одноцепочечной РНК. У него есть оболочка и спиральная сердцевина. Сердцевина состоит из восьми сегментов «-» РНК, которые в комплексе с белками образуют спиралевидные структуры. Каждый сегмент кодирует один из белков вируса. В наибольшем количестве вирус содержит белок матрикса, располагающийся на внутренней стороне оболочки и придающий ей стабильность. Все белки оболочки кодируются вирусной РНК, тогда как липиды являются по своему происхождению клеточными (см. ДНК-содержащие вирусы, сборка). Основные белки оболочки — гемагглютинин и нейраминидаза.

Инфекционный процесс протекает по схеме (прозрачка 2 внизу) начинается с прикрепления вируса к поверхности клетки-хозяина через гемагглютинин. Затем происходит слияние оболочки с клеточной мембраной, нуклеопротеиновая сердцевина (нуклеокапсид) входит в клетку, и кодируемая вирусом РНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует + цепи мРНК на вирусных «-» цепях, после чего на рибосомах клетки-хозяина продуцируются вирусные белки. Некоторые из этих белков играют важную роль в репликации вирусного генома.

Репликация происходит в ядре, где с помощью той же, но вероятно, модифицированной РНК-полимеразы образуются «-» цепи РНК. После того как в ядро проступают нуклеокапсидные белки, происходит сборка нуклеокапсида. Затем нуклеокапсид проходит цитоплазму, присоединяя по пути белки оболочки, и покидает клетку, отпочковываясь от ее плазматической мембраны. Считается, что в процессе отпочковывания принимает участие нейраминидаза.

Читать еще:  Увч терапия что это такое показания и противопоказания расшифровка механизм действий

Третью группу составляют двунитевые геномы, (±) РНК-геномы.

— Известные двунитевые геномы всегда сегментированы (т.е. состоят из нескольких разных молекул).

— Сюда относятся реовирусы. Их размножение проходит по варианту, близкому к предыдущему. Вместе с вирусной РНК в клетку попадает и вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза, которая обеспечивает синтез молекул (+) РНК. В свою очередь (+) РНК обеспечивает производство вирусных белков на рибосомах хозяйской клетки и служит матрицей для синтеза новых (-) РНК-цепочек вирусной РНК-полимеразой

Цепочки (+) и (-) РНК, комплексируясь друг с другом, образуют двунитевый (±) РНК-геном, который упаковывается в белковую оболочку.

Реовирусы птиц (от англ. respiratory респираторный, enteric кишечный, orphan сиротский) — это икосаэдрические вирусы без оболочки, белковый капсид которых состоит из двух слоев — наружнего и внутреннего. Внутри капсида находятся 10 или 11 сегментов двухцепочечной РНК.

Реовирусы поражают респираторные и кишечные пути теплокровных животных (человека, обезьян, крупного и мелкого рогатого скота, летучих мышей,

Инфекционный процесс начинается с проникновения в клетку РНК и затем протекает в соответствии со схемой (прозрачка 2 — внизу). После частичного разрушения наружнего капсида ферментами лизосом РНК в образовавшейся таким образом субвирусной частице транскрибируется, ее копии покидают частицу и соединяются с рибосомами. Затем в клетке-хозяине продуцируются белки, необходимые для формирования новых вирусных цастиц.

Репликация РНК вирусов происходит по консервативному механизму. Одна из цепей каждого сегмента РНК служит матрицей для синтеза большого числа новых + цепей. На этих + цепях образуются затем как на матрице — цепи , + и — цепи при этом не расходятся, а остаются вместе в виде двухцепочечных молекул. сборка новых вирусных частиц из новообразованных + и —сегментови капсидных белков связана каким-то образом с миотическим веретеном клетки-хозяина.

РНК-содержащие вирусы (РНК-> ДНК-» РНК).

— Сюда относятся вирусы, у которых цикл репликации генома можно разбить на две главные реакции: синтез РНК на матрице ДНК и синтез ДНК на матрице РНК.

— При этом в состав вирусной частицы в качестве генома может входить либо РНК (ретровирусы (Retroviridae — от REversed TRanscription)), либо ДНК (ретроидные вирусы).

— Вирусная частица содержит две молекулы геномной одноцепочечной (+) РНК.

— В вирусном геноме закодирован необычный фермент (обратная транскриптаза, или ревертаза), который обладает свойствами как РНК-зависимой, так и ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.

Только в 1970 г. американские ученые Г. Темин и Мицутани и независимо от них Д.Балтимор разрешили эту загадку. Они доказали возможность передачи генетической информации от РНК к ДНК. Это открытие перевернуло центральную догму молекулярной биологии о том, что генетическая информация может переноситься только в направлении ДНК-РНК-белок. Пять лет понадобилось Г. Темину для обнаружения фермента, осуществляющего перенос информации от РНК к ДНК, — РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Этот фермент получил название обратной транскриптазы. Г. Темину удалось не только получить фрагменты ДНК, комплементарные заданной цепи РНК, но и доказать что ДНК-копии могут встраиваться в ДНК клеток и передаваться потомству.

— Этот фермент попадает в заражаемую клетку вместе с вирусной РНК и обеспечивает синтез ее ДНК-копии сначала в одноцепочечной форме [(-) ДНК], а затем в двуцепочечной [(±) ДНК]:

— Вирусный геном в форме нормального дуплекса ДНК (так называемая провирусная ДНК) встраивается в хромосому клетки хозяина.

— В результате двуцепочечная ДНК вируса представляет собой в сущности дополнительный набор генов клетки, который реплицируется вместе с ДНК хозяина при делении.

— Для образования новых ретровирусных частиц провирусные гены (гены вируса в хромосомах хозяина) транскрибируются в ядре клетки транскрипционным аппаратом хозяина в (+) РНК-транскрипты.

— Одни из них становятся геномом нового «потомства» ретровирусов, а другие подвергаются процессингу в мРНК и используются для трансляции белков, необходимых для сборки вирусных частиц

В эту группу входят

а) вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)

— информация о СПИДе есть в Ветхом Завете

— в нашем ганоме есть генетические метки прежних пандемий СПИДа

Методы определения РНК вируса гепатита С в крови и особенности ПЦР-анализа

РНК гепатита С – это молекула, содержащая наследственную информацию вируса. Именно ее определяет анализ методом ПЦР (полимеразной цепной реакции). Это ключевой этап диагностики, подтверждающий инфицирование гепатитом. Также по строению РНК определяют генотип HCV. Эти данные нужны для выбора терапии, поскольку некоторые подтипы (3а, 3б) не поддаются традиционному лечению интерфероном. Для достоверного результата потребуется соблюдать правила подготовки к исследованию.

Что такое РНК вируса

РНК, или рибонуклеиновая кислота, – это уникальный генетический материал организма. У вирусных гепатитов С от конструкции РНК зависит устойчивость вируса к разным типам лечения и особенности протекания болезни. Появление в крови фрагментов вирусной РНК значит, что болезнь вступила в острую фазу.

У хронических больных в состоянии ремиссии кровь также содержит РНК гепатита С и антитела к ней, но в меньшем объеме, чем при обострениях. Тем не менее, этого количества вируса все равно достаточно для заражения здоровых людей.

Кому назначают диагностику

Обследование крови на РНК HCV нужно в таких случаях:

  1. При обнаружении антител или повышения печеночных ферментов у человека, считающегося здоровым. Анализы на разные виды гепатита проводят для выявления болезни или ее исключения из списка возможных причин разрушения клеток печени.
  2. Когда лечат уже обнаруженный гепатит для отслеживания эффективности терапии. Контроль за уровнем вирусной РНК в крови своевременно выявит резистентность (устойчивость) к принимаемым лекарствам.
  3. После выздоровления на протяжении года – чтобы вовремя заметить рецидив.

Техника проведения анализа

Методом ПЦР обнаруживают нуклеиновые элементы, входящие в состав белковой оболочки вируса. Полимеразная цепная реакция выявляет:

  • присутствие фрагментов HCV в крови;
  • уровень вирусной нагрузки – количество частиц в миллилитре крови;
  • генотип гепатита.

Важно правильно подготовиться к забору крови из вены для полимеразной реакции, чтобы не было искажений в результате теста. Для этого:

  1. Не употреблять алкоголь, энергетики, жирную и жареную пищу в течение 3 дней до сдачи теста.
  2. Избегать физических и нервных нагрузок за 2-3 дня до анализа.
  3. Отказаться от приема лекарств, а если это невозможно – уведомить врача о принимаемых препаратах.
  4. Не сдавать анализ во время обострения хронических вирусных болезней, а также при ОРВИ.
  5. При беременности и во время менструации предупредить врача о своем состоянии, поскольку гормональные нарушения в этот период вызывают искажения результатов.

Расшифровка

Обработка крови состоит из трех этапов:

  1. Определение РНК вируса гепатита в крови (качественный анализ).
  2. Оценка вирусной нагрузки (количественный анализ). Применяется только при положительном результате первого (когда в материале обнаружено присутствие вируса).
  3. Генотипирование. Его проводят при первом обращении по подозрению на гепатит, а также при низкой эффективности терапии – чтобы выявить мутацию вируса.

При подозрении на ложный результат потребуется повторно пройти обследование через 2 недели.

Качественный анализ

На оборудовании большинства лабораторий гепатит С будет выявлен, если количество частиц больше 50 МЕ/мл (международных единиц на миллилитр крови). Редкие диагностические аппараты способны выявить гепатит при уровне 10 МЕ/мл. При меньшем количестве частиц вируса будет получен ложноотрицательный результат (гепатита C не обнаружено).

Присутствие в крови антител с одновременным отрицательным результатом на тестирование по вирусу – причина пройти повторное обследование через 2 недели. Также можно обратиться в другую лабораторию с более современным оборудованием для диагностики.

Количественный анализ

По результатам количественного теста можно определить, насколько эффективно организм борется с гепатитом С. Этим тестом определяют прогресс болезни, а также действенность терапевтической программы. Уровень вируса в крови определяют в МЕ/мл. В зависимости от результатов пациента относят к одной из пяти групп:

  1. Здоров (вируса не обнаружено).
  2. Минимальный уровень вируса в крови (меньше 180 МЕ/мл. Условно здоров. Иногда может означать ложноположительный результат или скрытое носительство без болезни.
  3. Болен с низкой вирусной нагрузкой (менее 800 тыс. МЕ/мл)
  4. Болен с высокой вирусной нагрузкой (от 800 тыс. до 2.5 млн. МЕ/мл)
  5. Терминальная вирусная нагрузка (более 2,5 млн. МЕ/мл).

От регресса вирусной нагрузки зависит длительность терапии. При слишком медленном падении активности вируса (плохой эффективности терапии) лечение растягивается на полгода и более. Если вирус удастся уничтожить быстрей, срок лечения не превышает 3 месяцев.

Генотипирование

Существует 11 генотипов вируса с различными подтипами. Некоторые из них вводят больных в группу риска по онкологии и фиброзу сильней остальных, другие не поддаются стандартной терапии интерфероном. В идеале генотипирование нужно провести при первичном обнаружении гепатита. Но из-за ограниченности ресурсов к этому анализу прибегают только при отсутствии результатов терапии.

Если есть возможность сделать генотипирование платно, обязательно нужно ею воспользоваться. Этот анализ предотвратит потерю времени на терапию, которая может быть неэффективна при редком субтипе гепатита С.

Как часто нужно сдавать кровь на диагностику

Регулярное обследование на гепатит показано:

  • Людям, которые входят в группу риска из-за профессии или вредных привычек. К первым относятся врачи, ко вторым – наркоманы и люди, практикующие беспорядочные половые связи без использования презервативов.
  • Проходящим терапию – для отслеживания эффективности лечения.
  • Излечившимся от гепатита с целью предотвращения рецидивов.

Кровь на профилактическое обследование у группы риска берут раз 3-6 месяцев. Во время лечения потребуется сдавать анализы чаще – раз в 4-6 недель. При сомнениях в эффективности оборудования той лаборатории, где проводятся анализы, лучше сдать тест в нескольких клиниках одновременно.

РНК вируса гепатита С: что это такое, анализы на выявление

Определение РНК вируса гепатита С необходимо для установления типа данного заболевания. Зачастую от этого зависит жизнь пациента. Есть масса болезней, протекающих без характерной симптоматики, что мешает врачу быстро поставить правильный диагноз и назначить необходимое лечение. Установление РНК вируса гепатита способствует данному процессу.

Методика выявления заболевания

Сейчас заразиться гепатитом С может каждый. Ранее данное заболевание преобладало среди неблагополучного населения, в частности, наркоманов. Однако в настоящее время оно получило широкое распространение.

Гепатит С передается через кровь. В связи с этим заражение возможно в учреждении здравоохранения, и даже если вы делаете банальный маникюр у профессионального мастера. Инкубационный период составляет 6 месяцев, бессимптомная хроническая форма – до нескольких десятилетий, что приводит к циррозу. Острый гепатит С имеет следующие проявления:

  1. жар;
  2. апатичное состояние, постоянную усталость;
  3. рвоту либо тошноту;
  4. дискомфорт в абдоминальной области и суставах;
  5. желтуху.

Всемирная организация здравоохранения обозначила проблему быстрого темпа заражения данным заболеванием во многих странах мира. В профилактических целях необходимо сдавать анализ крови на гепатит С (или серологический скрининг на антитела ВГС).

Для выявления гепатита С проводится тестирование на рибонуклеиновую кислоту (РНК). Это способствует установлению типа болезни (острой либо хронической).

Опасность гепатита С кроется в его способности к мутированию. С помощью изменения строения гена он может стать невидим для иммунной системы. В этом случае тестирование выявит хронический гепатит С. Пациенту с подобным диагнозом делается биопсия печени (в целях установления серьезности поражения), а также проводится дополнительный тест на установление генотипа вируса.

Читать еще:  Чем опасен перегиб загиб желчного пузыря причины заболевания и способы лечения

Что такое РНК вируса гепатита С

Гепатит С представляет собой спектр вирусов, сгруппированных по генотипам и субтипам в структуре РНК. Таким образом, под действием различных веществ разные генотипы будут вести себя индивидуально. Всего известно 11 генотипов, но наиболее распространены 6 из них. Субтипов — около 500, каждый из которых демонстрирует своеобразную чувствительность к веществам.

Анализ РНК вируса гепатита С необходим для определения методики лечения в конкретном случае. От ее выбора зависит степень ее же эффективности. Результат диагностики помогает прогнозировать дальнейшее развитие гепатита С. Иногда биопсия печени производится после анализа РНК.

Генотипы возбудителя распространены в мире неоднородно:

  • 1 и 2 характерны для Западной Европы и Дальнего Востока;
  • 1 – для США;
  • 1b – Японии;
  • 4 – Магриба;
  • 6 – Южной Африки.

В целом генотипы 1, 2, 3 являются наиболее распространенными в мире. Они же характерны для постсоветских стран.

Генотип 1b

Субтип 1b вируса гепатита С распространен в Центральной и Восточной Европе, а также в Азии. Для него характерны:

  • хроническая форма;
  • бессимптомность;
  • провоцирование цирроза, гепатоцеллюлярной карциномы, а также тяжелых внепеченочных осложнений, которые приводят к смертельному исходу;
  • отсутствие результата при терапии интерфероновыми препаратами;
  • лечение по схеме «Даклатасвир»+«Асунапревир» («Софосбувир») позволяет добиться стойкого вирусологического ответа.

Генотипы 3а и 3в

РНК вируса гепатита С 3а и 3в являются вторыми по распространенности в странах СНГ после 1b. Для них типичны:

  • редкость хронической формы;
  • поражаемость желчных протоков, стеатоз (скопление жировой ткани в печени);
  • редкость цирроза;
  • лечение «Рибавирином» предполагает учет массы тела пациента (при 3a дозировки определяются лечащим врачом в индивидуальном порядке).

Определение РНК вируса гепатита С

Необходимость тестирования определяет гепатолог либо инфекционист. Сама процедура предполагает забор венозной крови у пациента. Перед манипуляцией следует воздержаться от курения, приема алкоголя и наркотических веществ.

Анализ РНК вируса гепатита С позволяет подтвердить или опровергнуть диагноз. Но иногда он не дает определенного результата. Если генотип установить невозможно, это не означает, что пациент на самом деле здоров. Подобный результат может указывать на:

  • нетипичность вируса в данном регионе (тогда берут другие реагенты, чтобы определить реакцию на иные виды гепатита);
  • пониженную концентрацию вирусной РНК в крови (требуется более мощное и чувствительное оборудование).

Иногда у пациента могут обнаруживать несколько видов гепатита С. Тогда после лечения одного типа устраняют другой.

На результат теста непосредственно влияют условия сдачи анализа, а также хранение полученного материала. В связи с этим следует отдавать предпочтение зарекомендовавшим себя лабораториям.

Может быть, в будущем разработают пан-генотипические методы терапии, которые сделают генотипирование не целесообразным. Однако в настоящий момент это — единственный способ установления вида гепатита С.

Норма количественного исследования РНК вируса гепатита С

Нормой при расшифровке анализа на РНК гепатита С считается число, которое количественно нулю.

Анализ должен быть проведен качественно, особенно у пациента, имеющего антитела к вирусу.

  1. Если анализ показал результат менее 400 тыс. МЕ/мл, это означает минимальное наличие вируса, но не его отсутствие.
  2. Показатель более 800 тыс. МЕ/мл считается высоким.

Цена на определение РНК гепатита С

Цена может варьироваться от 500 рублей до 5 000 руб. Это зависит от качества реактивов, используемых в процессе исследования.

За границей известен метод транскрипционной амплификации (ТМА). Он имеет высокую чувствительность в пределах 5–10 МЕ/мл. Однако до России эта методика еще не дошла.

Анализ на РНК вируса гепатита С необходим для скорейшего назначения подходящего лечения. Кроме того, знание о диагнозе поможет уберечь здоровье близких людей пациента. Тест на наличие вируса гепатита, особенно методом ПЦР, является залогом успеха лечения.

РНК вируса гепатита С

«Выявление генов вируса гепатита С (HVC) в крови пациента является вторым этапом лабораторной диагностики этой инфекционной патологии. Чтобы обнаружить возбудителя, который не имеет клеточной мембраны и, соответственно, поверхностных антигенов, используют метод полимеразной цепной реакции. С помощью этого метода определяют непосредственно молекулу, в которой закодирована вся его генетическая информация — РНК.

РНК — Рибонуклеиновая кислота, наряду с ДНК входит в состав клеток всех живых организмов. Вирус гепатита С содержит молекулу РНК и имеет способность к ее мутациям.

Исследование на наличие генома HVC назначают обычно после того, как проводят общий, биохимический анализ крови и получают положительный ответ на антитела (anti-HVC).

Что это значит?

Исследование на антитела к HVC является скрининговым, то есть с его помощью можно обследовать большие контингенты населения (медиков, беременных, пациентов стационаров, доноров, инъекционных наркоманов, ВИЧ-инфицированных). Отрицательный результат лабораторного анализа anti-HVC говорит о том, что в крови обследуемого не обнаружено иммунной реакции на вирус. Отрицательный результат может быть получен в таких случаях:

Если человек никогда не заражался гепатитом С.

Если чувствительность лабораторной тест-системы оказалась ниже, чем концентрация anti-HVC.

Если инфицирование произошло менее 2 месяцев назад и anti-HVC в крови еще недостаточно для определения. При ложноотрицательном ответе по причине человеческого фактора.

Если же получен результат, что антитела к HVC у больного обнаружены, это значит, что вирус гепатита С находился в организме обследуемого на момент проведения исследования или был в крови некоторое время назад. При положительном результате на anti-HVC возникает необходимость проведения дополнительных лабораторных исследований, которые обнаружат генетический материал самого возбудителя, определят концентрацию его генов (вирусную нагрузку, виремию) и установят генотип.

Анализ на РНК вируса гепатита С

Геном HVC в лабораторных условиях можно обнаружить с помощью нескольких исследований:

  • разветвленной ДНК (р-ДНК);
  • транскрипционной амплификации (ТМА);
  • полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Метод р-ДНК — недорогой и простой способ обнаружения вирусного генома у большого количества обследуемых людей. Его главным недостатком является низкая чувствительность: выявляет HVC только при его концентрации свыше 500 МЕ/мл.

Метод транскрипционной амплификации обнаруживает в сыворотке крови нуклеиновые кислоты вируса. Анализ имеет высокую чувствительность (5-10 МЕ/мл), но он еще недостаточно внедрен в повсеместную лабораторную практику.

Метод ПЦР в России является самым распространенным и доступным лабораторным обследованием с высокой чувствительностью (от 50-60 МЕ/мл).

Исследование ПЦР выполняется в любой клинической лаборатории, имеющей соответствующую аккредитацию. Очень важным нюансом этого метода диагностики, который влияет на результат анализа, является чувствительность используемой в лаборатории тест-системы. Например, чувствительность диагностикума 60 МЕ/мл, как в лабораториях «Инвитро», позволяет обнаруживать вирусную РНК спустя 3 месяца после заражения. При низкой чувствительности тест-системы гены возбудителя могут не обнаруживаться даже спустя 4 месяца после инфицирования.

РНК вируса гепатита С: метод ПЦР

Метод ПЦР имеет множество преимуществ перед другими лабораторными исследованиями для обнаружения генов HVC:

  • высокая чувствительность. Метод позволяет определять генетический материал возбудителя даже при его минимальной концентрации в образце;
  • большая специфичность. Выявляет гены вируса определенного генотипа среди множества ДНК и РНК других возбудителей, что позволяет проводить генотипирование возбудителя;
  • быстрота проведения. Отсутствие длительного процесса культивирования возбудителя сокращает время получения результата до нескольких часов; универсальность анализа.

Универсальная процедура проведения исследования позволяет одновременно использовать один образец крови человека для обнаружения генетического материала разных возбудителей. Эти преимущества позволяют считать ПЦР «золотым стандартом» лабораторной диагностики вирусного гепатита С вместе с иммуноферментным анализом на anti-HVC.

ПЦР — это исследование, используемое для определения генов HVC в крови обследуемого человека. Исследование состоит из нескольких этапов:

  • Отбора образца биоматериала.
  • Многократного увеличения концентрации копий РНК в отобранном образце.
  • Обнаружения генетического материала с помощью специальных тест-систем.

После забора венозной крови у пациента проводят искусственное инициирование процесса множественного реплицирования (амплификации, копирования) генов HVC.

Для этого определенным способом несколько раз изменяют температуру внутри пробирки с биоматериалом. Когда количество копий РНК в пробирке достигает необходимого значения, проводят обнаружение возбудителя с помощью специальных тест-диагностикумов.

  • качественной (обнаруживает присутствие вируса),
  • количественной (определяет концентрацию вирусных генов в единице объема)
  • генотипической (устанавливает генотип возбудителя).

РНК гепатита С: качественный анализ

Задача качественного ПЦР — определение наличия HVC в представленном биоматериале. Это исследование проводится обычно для скрининговой диагностики заболевания или выявления носительства. Назначают его после того, как выявят anti-HVC методом ИФА.

Чтобы поставить диагноз гепатита С, достаточно обнаружить генетический материал HCV качественно, то есть без подсчета его концентрации в объеме крови. Результатом качественного ПЦР может быть: «РНК обнаружено» или «РНК не обнаружено».

syringe needle with droplet of blood in front of a finger and on blue bacjground

Точность метода соответствует 95%. При этом точность самих тест-диагностикумов достигает 100%, а 5% — это человеческий фактор, который всегда присутствует в лабораторных исследованиях. Чтобы избежать ложноотрицательного анализа, особенно у людей с низкой виремией, необходима высокая чувствительность применяемой в исследовании диагностической системы. Чувствительность тест-системы должна быть не меньшей, чем 60 МЕ/мл.

РНК гепатита С: количественный анализ

Количественный анализ назначают тогда, когда нужно знать уровень виремии в организме человека. Показаниями для проведения этого исследования являются:

  • положительный результат качественного ПЦР при условии обнаружения антител к вирусу;
  • установление стадии патологии;
  • определение вирусной нагрузки при гепатитах;
  • выбор комбинации противовирусных препаратов;
  • мониторинг вирулогического ответа на проводимую противовирусную терапию;
  • оценка вероятности перехода острого гепатита С в хронический.

Результат анализа выражается в МЕ/мл (международных единицах в 1 мл сыворотки) или в копиях/мл (количестве копий генов вируса в 1 мл сыворотки). Количественный ПЦР не имеет нормы: в норме ген HVC в крови человека обнаруживаться не должен. Полученные результаты обследования сравнивают с референсными значениями, установленными для той или иной степени вирусной нагрузки.

Так, показатели (в МЕ/мл):

  • ниже 4×10*5 считаются низкой виремией;
  • от 4×10*5 до 8×10*5 — средней;
  • свыше 8×10*5 — высокой.

Чем больше копий вирусной РНК в крови, тем агрессивнее протекает заболевание и больше риск передачи вируса окружающим. Но уровень вирусной нагрузки — не единственный показатель, влияющий на тяжесть течения патологии и дальнейший прогноз для пациента: важен также генотип возбудителя.

Установление генотипа необходимо для назначения правильной схемы лечения. От него также зависит прогноз для здоровья и жизни пациента. Например, вирус 3 генотипа чаще приводит к фиброзу или циррозу печени, в сравнении с пациентами носителями 1 генотипа.

Гепатит С: анализы и расшифровка

РНК Диагноз гепатита С невозможно поставить только по результатам только качественного и/или количественного анализа ПЦР: определения HVC и уровня вирусной нагрузки недостаточно для назначения адекватной противовирусной терапии. Потенциального больного нужно обследовать комплексно (клинически, лабораторно, инструментально), чтобы иметь объективную картину патологии. Правильно назначить комплекс обследований для установления диагноза гепатита С, а затем грамотно расшифровать полученные результаты может только врач.

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector